Laboratorio de Biopatología Molecular

• Introducción
   
• Diagnóstico Molecular
   
• Técnicas Moleculares
   
• Cartera de servicios
   
• Biobanco

Introducción
 

El Consorcio Hospitalario Provincial de Castellón, en el año 2001, tuvo la iniciativa de poner en marcha el primer banco de tumores de la provincia asociado a un pequeño laboratorio de biología molecular.

Posteriormente, en el año 2007, se creó el Laboratorio de Biopatología Molecular, gracias a la colaboración de la Fundación del Hospital Provincial de Castellón, la cual ayudó en la dotación de equipamiento y personal necesario para la investigación, con el principal objetivo de trasladar los avances en investigación en el campo de la oncología molecular a la práctica clínica, de modo que todos los pacientes oncológicos de la provincia de Castellón puedan beneficiarse.

Diagnóstico Molecular

El avance en las técnicas de manipulación del material genético y el conocimiento cada vez más profundo del genoma humano y otros animales modelo nos conducen a un nuevo concepto de la Medicina, en el que el Diagnóstico Molecular desempeña un papel fundamental en numerosas especialidades médicas.

En el campo de la Microbiología, el conocimiento del genoma completo de un gran número de animales modelo y de gran cantidad de virus, bacterias, hongos y parásitos han permitido detectar el microorganismo implicado en muchas enfermedades e infecciones humanas.

Por otro lado, en el campo de la Oncología, las alteraciones genéticas que aparecen en los tumores constituyen la base molecular del cáncer. Una mutación se define como un cambio en la secuencia de ADN. Las mutaciones se pueden clasificar de distintos modos, en función de las células que afectan: mutaciones que afectan a las células germinales, lo que supone una predisposición genética a desarrollar cáncer (tumores de tipo familiar o hereditario) y mutaciones que afectan a las células somáticas (tumores de tipo esporádico).

Durante el proceso de carcinogénesis, las células tumorales acumulan numerosas alteraciones moleculares en numerosas neoplasias humanas. La mayor parte de estas alteraciones ocurren en determinados genes como son los proto-oncogenes (cuyas alteraciones los transforman en oncogenes, activando de forma positiva el crecimiento y la división celular) y los genes supresores de tumores (inactivando genes que inhiben el crecimiento y la división celular).

A grandes rasgos, estas alteraciones pueden afectar a distintos niveles: a nivel cromosómico y a nivel génico. Las de nivel cromosómico pueden ser alteraciones en el número de cromosomas (genómicas) como euploidías y aneuploidías y alteraciones en la estructura de los cromosomas (cromosómicas) como deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Por otro lado, las de nivel génico suponen alteraciones puntuales en la secuencia de un gen como sustituciones, adiciones o deleciones génicas.

Técnicas Moleculares

PCR

TÉCNICAS DETECCIÓN Y SCREENING DE MUTACIONES

HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH)

MICROARRAYS

Cartera de servicios

APLICACIONES DE LA PCR:

EN ONCOLOGÍA

Diagnóstico de leucemias y linfomas:

Monoclonalidad B y T.

Translocaciones:

• t(14;18): linfoma folicular ó difuso de células grandes.
• t(11;14): linfoma del manto.
• t(11;18): linfomas MALT.
• t(9;22): leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, etc, ...

Diagnóstico de enfermedad (carga tumoral) mí­nima residual para monitorización del tratamiento oncológico. Detección del DNA en sangre, médula ósea, torunda cervical:

• EBV (carcinomas nasofarí­ngeos y algunos linfomas).
• Translocaciones (leucemias, linfomas).
• Reordenamiento monoclonal B y T (leucemias y linfomas).
• HPV (seguimiento cáncer de cérvix postconización, etc,

Estudio de polimorfismos útiles en Farmacogenómica:

• CYP2D6 (en pacientes con càncer de mama hormonodependiente tratadas con tamoxifeno).
• UGT1A1 (en pacientes tratados con irinotecan).
• TS (en pacientes con carcinoma colorrectal tratados con 5-Fu).

Análisis de mutaciones:

Aplicaciones en el diagnóstico de cáncer hereditario:

• BRCA1 (cáncer de mama y ovario hereditario)
• BRCA2 (cáncer de mama y ovario hereditario)
• MLH1 (carcinoma colorectal hereditario no polipósico)
• MSH2 (carcinoma colorectal hereditario no polipósico)
• MSH6 (carcinoma colorectal hereditario no polipósico)
• APC (poliposis adenomatosa familiar)
• RB (retinoblastoma)
• MEN1, MEN2, y RET (carcinoma de tiroides)

Aplicaciones en adenocarcinoma no microcí­tico de pulmón:

• EGFR, para el tratamiento con gefitinib ó erlotinib.

Aplicación en sí­ndromes mielodisplásicos (policitemia vera, trombocitemia esencial, etc):

• JAK2, útil para el diagnóstico y también para la elección del tratamiento.

Aplicación en carcinoma colorectal metastásico:

• KRAS, predictivo de respuesta a cetuximab ó panitumimab.
• BRAF, factor pronóstico y predictivo de respuesta.

Aplicación en melanoma metastásico:

• BRAF, factor predictivo de respuesta a nuevos tratamientos.

Análisis de hipermetilación en promotores:

Aplicación en gliomas:

• MGMT, útil para el empleo de agentes alquilantes en la quimioterapia.

Aplicación en tumores de mama:

• BRCA1, útil para el empleo de inhibidores de la PARP.

EN MICROBIOLOGÍA

VIRUS

1. Detección, tipado y cuantificación de HCV (virus de hepatitis C).

2. Detección, tipado y cuantificación de HPV (virus del papiloma humano).

3. Detección y cuantificación de virus de la familia Herpes (Herpesviridae):

   1. HSV-1 (virus herpes tipo 1)

   2. HSV-2 (virus herpes tipo 2)

   3. VZV (virus de varicela zoster)

   4. EBV (virus de Epstein Barr)

   5. CMV (citomegalovirus)

OTROS MICROORGANISMOS

Bacterias GRAM+:

- Staphilococcus aureus (meticilin resistente ó no).

- CoNS (Staphilococcus coagulasa negativos).

- Streptococcus pneumoniae.

- Streptococcus spp.

- Enterococcus faecium.

- Enterococcus faecalis

Bacterias GRAM-:

- Escherichia coli.

- Klebsiella (pneumoniae / oxytoca).

- Serratia marcescens.

- Enterobacter (cloacae / aerogenes).

- Proteus mirabilis.

- Pseudomonas aureginosa.

- Acinetobacter baumanii.

- Stenotrophomonas maltophila.

Hongos:

- Candida albicans.

- Candida glabrata.

- Candida parapsilosis.

- Candida krusei.

- Candida tropicalis.

- Aspergillus fumigatus.

Parásitos:

- Toxoplasma gondii

APLICACIONES DE LA TÉCNICA FISH EN ONCOLOGÍA:

Amplificación del HER-2/neu, en cancer de mama y tumores gástricos para el tratamiento con trastuzumab.

Amplificación del EGFR, en cáncer de pulmón no microcí­tico para el tratamiento con gefitinib o erlotinib.

Translocaciones diversas, en leucemias, linfomas (las mismas que hemos visto por PCR).

Translocaciones en sarcomas y otros tumores sólidos.

Aneuploidias de los cromosomas 3, 7, y 17, además de pérdida del locus 9p21 (región que contiene el gen p16 supresor de tumores) en cáncer de vejiga.

Pérdidas de heterocigosidad (LOH), en gliomas.

Biobanco

INTRODUCCIÓN:

Segín el artí­culo 3 de la Ley 14/2007 de Investigación biomédica se define como biobanco un establecimiento público o privado, sin ánimo de lucro, que acoge una colección de muestras biológicas concebida con fines diagnósticos o de investigación biomédica y organizada como una entidad técnica con criterios de calidad, orden y destino.

En el Consorcio Hospitalario Provincial de Castellón, el Biobanco tuvo su origen en abril de 2001 con la finalidad de conservar muestras biológicas de neoplasias humanas en condiciones adecuadas de criopreservación y actualmente forma una red de recogida de tumores junto con el Hospital La Plana de Vila-Real y el Hospital de Vinaroz.

OBJETIVOS:

Los objetivos del Biobanco están de acuerdo con lo establecido en el Plan Estratégico para la constitución de la RBTCV (Red de Banco de Tumores de la Comunidad Valenciana):

1. Recoger en condiciones óptimas:
   

   Tumores en los que se sospeche que puede existir una predisposición hereditaria (mama y ovario, colorrectal no poliposico, poliposis adenomatosa, medular de tiroides, MEN1, MEN2A, MEN2B, retinoblastoma).

Fondos mí­nimos de los tipos tumorales más frecuentes.

Casos directamente derivados de los Comités de Tumores, que por su naturaleza particular suusciten especial interés.

El mayor número de casos de procesos inusuales, incluyendo patologí­as inflamatorias raras, etc.

Capacidad de colección prospectiva de series de patologí­as especí­ficas que sean solicitadas por grupos de investigación.

Colaborar en la recogida de material biológico para ensayos clí­nicos.

2. Garantizar la calidad del material mediante un análisis morfológico de las muestras incluidas en el banco y asegurar su correlación anatomo-patológica con el diagnóstico definitivo de la muestra.

3. Suministrar, sin ánimo de lucro, el anterior material biológico a grupos de investigación de la propia institución o ajenos a la misma, que cumplan los requisitos cientí­ficos y éticos exigibles para el uso de este tipo de muestras , en el marco de un acuerdo claro de transferencia entre ambas partes.

MUESTRAS:

El Biobanco está formado por una colección de muestras de tejidos tumorales y normales (Banco de Tumores) y una colección de muestras de sangre y derivados (Seroteca). Actualmente contamos con más de 6.000 muestras provenientes del Banco de Tumores y 15.000 muestras provenientes de la Seroteca.

LOCALIZACIÓN:

El Biobanco del Hospital Provincial de Castellón está situado en el laboratorio de Biopatologí­a Molecular, en la 2ª planta del edificio Montesinos del hospital.

INFRAESTRUCTURA:

El Biobanco dispone de una habitación con la temperatura controlada (15ºC) en la que están ubicados dos ultracongeladores verticales a -85ºC. Ambos cuentan con las siguientes medidas de control de temperatura:

• Sensor acústico y luminoso que se dispara cuando la temperatura aumente en un 10% del total (8,5ºC). Este sensor es instantáneo dentro del laboratorio y en el Servicio de Vigilancia del hospital.
• Balas de CO2 que insuflarán su gas dentro del arcón en el caso de que la temperatura suba a los -50ºC. Ambas están controladas por manómetros y balanzas para garantizar que no estén vacías.
• Registro gráfico de temperaturas a un ordenador del laboratorio y a otro en Servicio de Mantenimiento, donde también tienen orden de llamar por teléfono cuando se registre alguna incidencia.
• Conexión de lo ultracongeladores a grupo electrógeno para que no se queden sin suministro eléctrico en caso de que falle la fuente habitual.

En cuanto al sistema de transporte y congelación de las muestras en nuestro caso particular lo hemos realizado por inmersión directa en nitrógeno lí­quido mediante el uso de recipientes adecuados:

• Recipiente (dewar) de 2 litros para el transporte de las muestras.
• Recipiente (dewar) de 11 litros para congelación de las muestras.

Los hospitales de La Plana y Vinaroz han empleado también estos dewars para el transporte y congelación de las muestras, utilizando un protector para el transporte con vehí­culos.

RESPONSABLES (R.R.H.H):

El Biobanco, según el artí­culo 66 de la ley 14/2007 de Investigación biomédica establece que el biobanco deberá contar con un director cientí­fico, un responsable del fichero y estará adscrito a sendos comités externos, uno cientí­fico y otro de ética, respectivamente, que asistirán al director del biobanco en sus funciones.

PROCEDIMIENTO:

Las muestras congeladas se guardan en criotubos con números de referencia específicos del hospital de procedencia, que a su vez se ordenan en cajas, y éstas en racks en los ultracogeladores.

Para la recopilación de datos hemos utilizado el programa ACCESS del Office de Word generando una base de datos tanto para el Banco de Tumores como para la Seroteca. También existen libros de registro para cada hospital del Biobanco y libro de incidencias.

En nuestro hospital el Biobanco tiene relación con los Comités de ética e Investigación, con el Comité de Tumores, con los Servicios de Cirugí­a, Oncologí­a y Radioterapia, con el Registro de Tumores, y finalmente con el programa informático Kewan que posee una base de datos muy potente de todos los pacientes oncológicos.

Facultativos de distintas especialidades de nuestro hospital y de otros hospitales están desarrollando proyectos de investigación que están requiriendo muestras del Biobanco principalmente de la Seroteca. Cuando se han requerido muestras del Biobanco por laboratorios externos, han sido anonimizadas y además los proyectos han pasado por los Comités de Ética y de Investigación. Estas muestras fueron siempre anteriores a la Ley de Investigación Biomédica de Julio de 2007.