Laboratori de Biopatologia Mol·lecular

• Introducció

• Diagnòstic Mol·lecular

• Tècniques Mol·leculars

• Cartera de serveis

• Biobanc

Introducció
 

Diagnóstic Mol·lecular
 

Tècniques Mol·leculars

PCR

TÈCNIQUES DETECCIÓ I SCREENING DE MUTACIONS

HIBRIDACIÓ IN SITU FLUORESCENT (FISH)

MICROARRAYS

L’estudi dels genomes comprén la identificació, organització i estructura de tots els gens d’un organisme  (Genòmica estructural) però també descobrir la seua funció i mecanismes implicats en la seua regulació (Genòmica funcional).

Han aparegut noves ferramentes d’anàlisi massiva de gens de manera simultani com són els microarrays (arrays o biochips). Un microarray es definix com un nombre de molècules ordenades sobre un substrat sòlid. Als elements o fragments d'ADN immobilitzats sobre el suport se’ls denomina sondes (“probes”) i a les molècules diana (“target”). El material genètic de la mostra a analitzar es marca per diversos mètodes i es cova amb les sondes, permetent la hibridació de seqüències homòlogues. Per tant, les seqüències de la mostra marcades s’uniran a les seues seqüències complementàries immobilitzades en el suport, permetent la identificació i quantificació de l'ADN present en la mostra. Posteriorment l’anàlisi d’imatge i les ferramentes informàtiques permetran interpretar i analitzar les dades obtingudes.

Hi ha distints tipus d’arrays: d’expressió (cDNA, oligonucleótids, miRNA), d'ADN (SNPs, arrays-CGH), de proteïnes, de teixits (“tissue-arrays”) i d’alteracions epigenètiques (arrays de metilació, Chip-on-chip).

Cartera de serveis

APLICACIONS DE LA PCR:

EN ONCOLOGIA

Diagnòstic de leucémies i linfomes:

Monoclonalitat B i T.

Translocacions:

• t(14;18): linfoma fol·licular o difús de cél·lules grans.

• t(11;14): linfoma del manto.

• t(11;18): linfomes MALT.

• t(9;22): leucémia mieloide crónica, leucémia linfoblàstica aguda, etc, ...

Diagnòstic de malatia (càrrega tumoral) mí­nima residual per a  monitorització del tratament oncològic. Detecció del DNA en sang, mèdul·la óssia, tampó cervical:

• EBV (carcinomes nasofaringis i alguns linfomes).

• Translocacions (leucèmies, linfomes).

• Reordenament monoclonal B i T (leucèmies i linfomes).

• HPV (seguiment càncer de cervix postconizació, etc,

Estudi de polimorfismes útils en Farmacogenómica:

• CYP2D6 (en pacients amb càncer de mama hormonodependent tractades amb tamoxifeno).

• UGT1A1 (en pacients tractats amb irinotecan).

• TS (en pacients amb carcinoma colorectal tractats amb 5-Fu).

Anàlisi de mutacions:

Aplicacions en el diagnòstic de càncer hereditari:

• BRCA1 (càncer de mama i ovari hereditari)

• BRCA2 (càncer de mama i ovario hereditari)

• MLH1 (carcinoma colorectal hereditari no polipósic)

• MSH2 (carcinoma colorectal hereditari no polipósic)

• MSH6 (carcinoma colorectal hereditari no polipósic)

• APC (poliposis adenomatosa familiar)

• RB (retinoblastoma)

• MEN1, MEN2, y RET (carcinoma de tiroide)

Aplicacions en adenocarcinoma no microcrà­tic de pulmó:

• EGFR, per al tractament amb gefitinib o erlotinib.

Aplicació en sí­ndromes mielodisplàsics (policitemia vora, trombocitemia esencial, etc):

• JAK2, útil per al diagnòstic i també per a la elecció del tractament.

Aplicació en carcinoma colorectal metastàtic:

• KRAS, predictiu de resposta a cetuximab o panitumimab.

• BRAF, factor pronòstic i predictiu de resposta.

Aplicació en melanoma metastàsic:

• BRAF, factor predictiu de resposta a nous tractaments.

Anàlisis de hipermetilació en promotors:

Aplicació en gliomes:

• MGMT, útil per a l'ocupació d'agentss alquilants en la quimioteràpia.

Aplicació en tumors de mamella:

• BRCA1, útil per a l'ocupació d'inhibidors de la PARP.

EN MICROBIOLOGIA

VIRUS

1. Detecció, tipat i cuantificació de HCV (virus de hepatitis C).

2. Detecció, tipat i quantificació de HPV (virus del papil·loma humà ).

3. Detecció i quantificació de virus de la familia Herpes (Herpesviridae):

   1. HSV-1 (virus herpes tipo 1)

   2. HSV-2 (virus herpes tipo 2)

   3. VZV (virus de varicel·la zàster)

   4. EBV (virus d'Epstein Barr)

   5. CMV (citomegalovirus)

ALTRES MICROORGANISMES

Bacteris GRAM+:

- Staphilococcus aureus (meticilin resistent  no).

- CoNS (Staphilococcus coagulasa negatius).

- Streptococcus pneumoniae.

- Streptococcus spp.

- Enterococcus faecium.

- Enterococcus faecalis

Bacteris GRAM-:

- Escherichia coli.

- Klebsiella (pneumoniae / oxytoca).

- Serratia marcescens.

- Enterobacter (cloacae / aerogenes).

- Proteus mirabilis.

- Pseudomonas aureginosa.

- Acinetobacter baumanii.

- Stenotrophomonas maltophila.

Fongs:

- Càndida albicans.

- Càndida glabrata.

- Càndida parapsilosis.

- Càndida krusei.

- Càndida tropicalis.

- Aspergillus fumigatus.

Paràsits:

- Toxoplasma gondii

APLICACIONS DE LA TÉCNICA FISH EN ONCOLOGIA:

Amplificació del HER-2/neu, en càncer de mamella i tumors gàstrics per al tractament amb trastuzumab.

Amplificació del EGFR, en càncer de pulmó no microcà­tic per al tractament amb gefitinib o erlotinib.

Translocacions diverses, en leucèmies, linfomes (les mateixes que hem vist per PCR).

Translocacions en sarcomes i altres tumors sólids.

Aneuploidias dels cromosomes 3, 7, y 17, a més de pèrdua del locus 9p21 (regió que conté el gen p16 supressor de tumors) en càncer de bufeta.

Pèrdues de heterocigositat (LOH), en gliomes.

Biobanc

INTRODUCCIÓ:

Segons l'article 3 de la Llei 14/2007 d'Investigació biomèdica es definix com biobanc un establiment públic o privat, sense ànim de lucre, que acull una col·lecció de mostres biològiques concebuda amb fins diagnòstics o d'investigació biomèdica i organitzada com una entitat tècnica amb criteris de qualitat, orde i destí­.

En el Consorci Hospitalari Provincial de Castelló, el Biobanc va tindre el seu origen a l'abril de 2001 amb la finalitat de conservar mostres biològiques de neoplà sies humanes en condicions adequades de criopreservació i actualment forma una xarxa d'arreplega de tumors junt amb l'Hospital La Plana de Vila-Real i l'Hospital de Vinarós.

OBJECTIUS:

Els objectius del Biobanc estan d'acord amb el que establix el Pla Estratègic per a la constitució de la RBTCV (Xarxa de Banc de Tumors de la Comunitat Valenciana):

1. Arreplegar en condicions óptimes:

   Tumors en qué se sospite que pot existir una predisposició hereditària (mamella i ovari, colorectal no poliposico, poliposis adenomatosa, medul·lar de tiroide, MEN1, MEN2A, MEN2B, retinoblastoma).

• Fons mínims dels tipus tumorals més frequents.

• Casos directament derivats dels Comités de Tumors, que per la seua naturalesa particular suusciten especial interés.

• El nombre més gran de casos de processos inusuals, incloent-hi patologies inflamatòries rares, etc.

• Capacitat de col·lecció prospectiva de sèries de patologies especí­fiques que siguen sol·licitades per grups d'investigació.

• Col·laborar en l'arreplega de material biològic per a assajos clí­nics.

2. Garantir la qualitat del material per mitjà  d'un anàlisi morfològic de les mostres incloses en el banc i assegurar la seua correlació anatomo-patològica amb el diagnòstic definitiu de la mostra.

3. Subministrar, sense ànim de lucre, l'anterior material biològic a grups d'investigació de la pròpia institució o aliens a la mateixa, que complisquen els requisits cientí­fics i étics exigibles per a l'ús d'este tipus de mostres , en el marc d'un acord clar de transferència entre ambdues parts.

MOSTRES:

El Biobanc està  format per una col·lecció de mostres de teixits tumorals i normals (Banc de Tumors) i una col·lecció de mostres de sang i derivats (Seroteca). Actualment comptem amb més de 6.000 mostres provinents del Banc de Tumors i 15.000 mostres provinents de la Seroteca.

LOCALITZACIÓ:

El Biobanc de l'Hospital Provincial de Castelló està  situat en el laboratori de Biopatologi­a Molecular, en la 2a planta de l'edifici Montesinos de l'hospital.

INFRAESTRUCTURA:

El Biobanc disposa d'una habitació amb la temperatura controlada (15ºC) en la que estan ubicats dos ultracongeladors verticals a -85ºC. Ambdós compten amb les següents mesures de control de temperatura:

• Sensor acústic i lluminàs que es dispara quan la temperatura augmente en un 10% del total (8,5ºC). Este sensor és instantani dins del laboratori i en el Servici de Vigilància de l'hospital.

• Bales de CO2 que insuflaran el seu gas dins del bagul en el cas que la temperatura puge als -50ºC. Ambdós estan controlades per manòmetres i balances per a garantir que no estiguen buides.

• Registre gràfic de temperatures a un ordinador del laboratori i a un altre en Servici de Manteniment, on també tenen orde de cridar per telèfon quan es registre alguna incidència.

• Connexió dels ultracongeladors a grup electrogen perquè no es queden sense subministrament elèctric en el cas que falle la font habitual.

Quant al sistema de transport i congelació de les mostres en el nostre cas particular ho hem realitzat per immersió directa en nitrogen líquid per mitjà  de l'ús de recipients adequats:

• Recipient (dewar) de 2 litres per al transport de les mostres.

• Recipient (dewar) d'11 litres per a congelació de les mostres.

Els hospitals de La Plana i Vinaròs han empleat també estos dewars per al transport i congelació de les mostres, utilitzant un protector per al transport amb vehicles.

RESPONSABLES (R.R.H.H):

El Biobanc, segons l'article 66 de la llei 14/2007 d'Investigació biomèdica establix que el biobanc haurà  de comptar amb un director científic, un responsable del fitxer i estarà  adscrit a sengles comités externs, un cientí­fic i un altre d'ètica, respectivament, que assistiran al director del biobanc en les seues funcions.

PROCEDIMENT:

Les mostres congelades es guarden en criotubos amb números de referència especí­fics de l'hospital de procedència, que al seu torn s'ordenen en caixes, i estes en racks en els ultracogeladores.

Per a la recopilació de dades hem utilitzat el programa ACCESS de l'Office de Word generant una base de dades tant per al Banc de Tumors com per a la Seroteca. També hi ha llibres de registre per a cada hospital del Biobanc i llibre d'incidències.

En el nostre hospital el Biobanc té relació amb els Comités d'ètica i Investigació, amb el Comité de Tumors, amb els Servicis de Cirurgia, Oncologia i Radioteràpia, amb el Registre de Tumors, i finalment amb el programa informàtic Kewan que posseïx una base de dades molt potent de tots els pacients oncològics.

Facultatius de distintes especialitats del nostre hospital i d'altres hospitals estan desenvolupant projectes d'investigació que estan requerint mostres del Biobanco principalment de la Seroteca. Quan s'han requerit mostres del Biobanco per laboratoris externs, han sigut anonimizadas i a més els projectes han passat pels Comités d'Ètica i d'Investigació.